Fagaktuelt

Små molekyler i hud- og gjelleslim kan forteIIe oss noe om fiskens fysiologi og helsetilstand

Metabolitter er mindre organiske molekyler som inngår i, eller er et produkt av reaksjoner i celler. Produksjonen og sammensetningen av metabolittene påvirkes av miljøet utenfor organismen. Kunnskap om sammensetningen av metabolitter kan fortelle noe om samspillet mellom fisken og miljøet, og gi innblikk i sykdomsutvikling eller helsetilstanden til et dyr. Våre mål er å kunne bidra til tidlig påvisning av sykdom, gi mer informasjon om forløpet i kjente sykdomstilstander og bidra til bedre behandlingsmetoder.

Av
Uhlig S
Tartor H
Gjessing M
Dahle M.
Ivanova L.

KUNNSKAP OM FISKEHELSE

I denne spalten vil Veterinærinstituttet i hvert nummer bidra med oppdatert kunnskap om fiskehelse. Ansvarlig for spalten er forsker Mona Gjessing mona.gjessing@vetinst.no

Metabolomikk sikter på å gi et helhetlig bilde av alle metabolittene

Suffikset «-omikk» refererer til en helhetlig analyse, og metabolomikk sikter derfor mot å analysere hele sammensetningen av metabolitter i en prøve. Noen ganger er man kun interessert i visse typer metabolitter, som for eksempel aminosyrer (byggestenene i proteiner), lipider (fett) eller metabolitter som inngår i en spesiell type biosyntese (dannelse av molekyler i en organisme). I de tilfellene setter man gjerne opp en målrettet analyse. Denne tilnærmingen blir kalt målrettet (targeted) metabolomikk.

Et eksempel for en slik type analyse kan være at man ønsker å finne ut hvordan forskjellige typer fôr påvirker fettsyresammensetningen i fisk. Andre ganger har man ingen forhåndskunnskap om hvilke typer metabolitter en bør studere. Da ønsker man å påvise så mange metabolitter som mulig uten at man nødvendigvis har noen klar tanke om hva man leter etter. Denne tilnærmingen blir kalt ikke-målrettet (untargeted) metabolomikk. Et eksempel kan være at en ønsker å teste om en ny type vaksine har en målbar effekt på metabolitt-nivå.

Figur 1. Absorpsjon av væskefasen fra hudslim hos laks.

Det finnes tusenvis av forskjellige metabolitter. Noen av disse er også reaktive og kan reagere med molekyler fra fôr og mat eller miljøet. Svært avanserte måleinstrumenter og kraftige datamaskiner inklusive egnete bio-informatiske verktøy som kan håndtere og prosessere de komplekse data brukes i analysene. Væskekromatografi som koples til høytoppløselig massespektrometri (LC–HRMS for liquid chromatography – high-resolution mass spectrometry)

er den vanligste metoden for å samle metabolomikkdata. Kromatografi separerer organiske molekyler i tid, mens massespektrometeret separerer molekyler i forhold til deres masse og ladning. Prosesseringen av rådata for metabolomikk fra slike instrumenter er omfattende og involverer flere forskjellige trinn og bioinformatiske verktøy.

Figur 2. Aminosyreprofilene i slim fra gjeller og hud fra laks målt med LC–HRMS (n=5).

Figur 3. L-karnitin of forskjellige acylerte karnitiner i mukus fra gjeller og hud fra laks målt med LC–HRMS (n=3).

Veterinærinstituttet har erfaring med å måle metabolitter i hud- og gjellemukus fra fisker

Flere metabolomikkstudier har visst et stort potensial i forhold til å beskrive sykdomsprosesser og risiko for fremtidig sykdom hos mennesker. Vi ønsket derfor å utvikle liknende analyser i prøver fra hud- og gjelleslim fra fisk som ble samlet inn på en ikke-invasiv måte. Dette er et arbeid som intensiveres i den pågående strategiske instituttsatsningen Bio- Direct. Metoden vi vanligvis benytter til prøveinnsamling bruker adsorpsjon av væskefasen med et medisinsk papir (Figur 1). Væsken fra papiret blir så sentrifugert og filtrert før analyse.

Gjennom flere prosjekter har vi prøvd ut forskjellige analytiske tilnærminger til målrettet og ikke- målrettet metabolomikk. Til målrettet metabolomikk benytter vi både et sett med cirka 90 referansesubstanser som vi ser etter i slimprøvene, eller vi bruker et kvantitativt metabolomikk-kit som kan kvantifisere 365 fettstoffer og 43 andre små molekyler. Vi har også gjennomført ikke-målrettet metabolomikk, spesielt av hudslim fra Atlantisk laks, ved flere anledninger. En finner ikke like mange metabolitter i hud- og gjelleslim sammenliknet med for eksempel blod.

I våre analyser finner vi vanligvis om lag 1000 metabolitter i slimprøvene. Figurene 2–3 viser eksempler på sammensetningen av hud- og gjelleslim med to utvalgte grupper metabolitter.

Eksempel: Gir behandling med vanlige bedøvelsesmidler (benzokain og Aqui-S) målbare utslag på metabolitt-sammensetningen av hud- og gjelleslim?

For å kunne ta slimprøver av fisk på en reproduserbar måte er man nødt til å bedøve den. Det er derfor viktig å finne ut om fisken får en målbar respons på en behandling med et bedøvelsesmiddel, slik at den responsen kan «filtreres ut» når formålet er å finne ut noe om forandringer i metabolittprofilen som følge av en sykdom. Benzokain og Aqui-S er vanlige sedativa som er i bruk. Aqui-S er et flytende preparat som lages av nellikolje, og som inneholder isoeugenol som virkestoff. Benzokain er et lite syntetisk molekyl som brukes mye som lokalbedøvelsesmiddel.

I et forsøk ble 3×5 fisker bedøvet med enten benzokain eller Aqui-S, og det ble tatt slimprøver. En kontrollgruppe fikk ikke noe bedøvelse. Vi samlet prøver fra hud- og gjelleslim fra alle individene. Prøvene ble analysert med ikke-målrettet metabolomikk for alle individene. Analysen viste en liten men signifikant effekt av Aqui-S behandlingen på metabolittsammensetningen, mens benzokain-behandlingen ikke viste noen tydelig effekt (Figur 4).

Det betyr at behandlingen av Atlantisk laks med Aqui-S ga en målbar biologisk respons, mens benzokain ikke ga en biologisk respons med metodikken som ble brukt her. Det jobbes videre med å finne ut hvilke metabolitter som står bak den målte forskjellen, men det første målet med forsøket var å få en liste med molekyldata som hjelper oss å plukke ut mistenkelige metabolitter som kan relateres til behandling med Aqui-S når middelet har blitt brukt som bedøvelsesmiddel i et forsøk.

Slik kunnskap er viktig fordi det gjør det mulig å «trekke fra» metabolitter som kan tilskrives bedøvelsen som blir brukt i et forsøk og vi kan konsentrere oss om markørene i slimet som sier noe om fiskens helsetilstand før den ble bedøvet.

Figur 4. Tredimensjonalt scores plot fra prinsipalkomponentanalyse av rådata fra 898 metabolitter som ble detektert i slim (mukus) fra hud eller gjeller fra laks etter behandling med benzokain og Aqui-S. Et slikt plot forteller noe om den totale variasjonen i et datasett og brukes som utgangspunkt for mer målrettete dataanalyser. De innrammete klyngene markerer prøvene av hud- og gjellemukus fra Aqui-S behandlete laks og er relativt tydelig separerte fra kontrollprøvene.