Immunorganet i gjellene – ILT

Gjeller er bygget opp av primærlameller og sekundærlameller der primærlamellene er festet til gjellebuen. I den histologiske diagnostikken er det sekundærlamellene, der gassutvesklingen i respirasjonssystemet finner sted, som er gjenstand for mest oppmerksomhet. I forbindelse med histologiske evalueringer av gjeller ved Faggruppe anatomi, observerte sisteforfatter (EOK) at det av og til fantes betydelige ansamlinger av immunceller i snitt fra gjellene. Selv om ansamlingene ikke var i de respiratoriske områdene, dukket de stadig opp på snitt uten noen tilsynelatende sammenheng med hvorvidt det var gjellebetennelse eller ikke. Videre var ansamlingene så store at de ikke kunne avskrives som et resultat av skråsnitt gjennom epitelet. Dette måtte undersøkes for å få klarhet i hva disse områdene med immunceller egentlig var og hvor de var plassert. Vanligvis blir gjeller innstøpt i «vifteprojeksjon» (mediolateral projeksjon) som muliggjør lett observasjon av det respiratoriske epitelet i sekundærlamellene (Figur 1a-c). For å få en oversikt og danne seg et tredimensjonalt bilde av de mikroskopiske strukturene, ble det dissekert og innstøpt gjeller i flere projeksjoner og forskjellige snittflater, og ikke bare den tradisjonelle orienteringen. Disse preliminære undersøkelsene ble utført i 2005-2007 på et relativt lavt antall gjeller. Undersøkelsene ga holdepunkter for at det fantes et stort lymfatisk vev på enden av det interbranchiale septum som forbinder primærlamellene i cirka 1/3 av deres proksimale del (Figur 1d). Disse funnene ble diskutert mellom sisteforfatter, daværende professor i anatomi, Inge Bjerkås (Figur 2) og daværende stipendiat ved Faggruppe anatomi, Erlend Haugarvoll. Vi lette i litteratur om gjeller, men fant intet som omhandlet noe lymfatisk vev hos noen art. Professor Barbara Nowak ved School of Aquaculture, University of Tasmania, en av de store eksperter innen gjelleforskning ble så kontaktet. Men heller ikke Barbara Nowak hadde hørt om lymfatiske strukturer i gjellene og ble meget interessert. På dette tidspunktet var Erlend Haugarvoll godt i gang med gradsarbeidet sitt relatert til immunceller hos fisk. De nye funnene ble diskutert med Haugarvolls biveileder professor Ivar Hordvik ved Institutt for biovitenskap (BIO), Universitetet i Bergen (Figur 3), som i årenes løp har vært en meget viktig samarbeidspartner for fiskeforskningen ved Faggruppe anatomi. Ivar Hordvik ga full tilslutning til at resultater fra undersøkelser rundt gjellenes immunsystem kunne inkluderes i Haugarvolls gradsarbeid. Erlend Haugarvoll gikk så i gang med innsamling av materiale, undersøkelser av vevet og beskrivelse av de lymfatiske strukturene. I 2008 ble funnene presentert i Journal of Anatomy (1). En videre karakterisering av vevet ble publisert to år etter, der også vevet ble navnsatt som «interbranchial lymphoid tissue» (ILT) (2). Det er disse to publikasjonene som har lagt fundamentet for den forskningsaktiviteten som siden har foregått rundt ILT. Artikkelen fra 2008 inngikk som en viktig del av Erlend Haugarvolls avhandling «Novel leukocyte localisations and characteristics in the Atlantic salmon» (NVH, Oslo, 2008. ISBN 978-82-7725-158-5).

På et tidlig tidspunkt diskuterte vi et åpenbart og viktig spørsmål, nemlig om ILT var unikt for laksefisk eller også fantes hos andre arter. I 2008 innhentet derfor Erling O. Koppang og Ivar Hordvik en betydelig mengde materiale fra forskjellige fiskearter inkludert bruskfisk (Figur 4) fra fjorden utenfor Hordvikneset og Steinestø. Undersøkelser av gjeller fra denne innsamlingen ga grunnlaget for å slå fast at ILT var til stede hos noen arter, men ikke hos andre. Disse preliminære observasjonene dannet basis for oppfølging av spørsmålet i videre forskning. Men først i 2020 ble det publisert en studie som tok for seg dette spørsmålet (3).

Funnet av et nytt organ med ukjent funksjon utløste forskningsmidler og stipendiatstillinger. Faggruppe for anatomi ble tildelt et FRIMEDBIO-prosjekt fra Norges Forskningsråd, og forsker Lars Austbø og ingeniør Elin Valen ble ansatt i prosjektet. Videre ble to stipendiatstillinger finansiert av Veterinærhøgskolen, begge dedikert til studier rundt ILT og koblet opp mot FRIMEDBIO-prosjektet. Dette resulterte i avhandlingene til Alf Seljenes Dalum som disputerte i 2017 med tittel «Studies of the interbranchial lymphoid tissue in the gills of Atlantic salmon and common carp» (NMBU Thesis 2017:17) og Ida Bergva Aas som disputerte i 2018 med tittel «Gene transcription studies on the interbranchial lymphoid tissue of Atlantic salmon – with emphasis on its role in the immune system« (NMBU Thesis 2018:22). Denne innsatsen avdekket mange og uventede aspekter rundt ILT. Utviklingen og utbredelsen av vevet ble nærmere karakterisert, og vevets reaksjoner på ILA-infeksjon ble undersøkt.

Transkriptomanalyser publisert i Ida Bergva Aas sitt gradarbeid ga viktig informasjon om vevets karakteristika og muliggjorde i tillegg ytterligere undersøkelser med bruk av in situ hybridiseringsteknikker der det endelig kunne fastslås at ILT kunne karakteriseres som et lymfatisk organ (4). Til sammen har disse undersøkelsene avslørt en god del om oppbygningen og den immunologiske kapasiteten hos ILT, men vi vet fremdeles lite om funksjonen og hva dette massive lymfatiske vevet egentlig er godt for. ILT består i hovedsak av T-celler i et nettverk av epitelceller, men også andre immunceller er til stede (Figur 5). Ikke bare ser ILT annerledes ut enn alle andre tidligere kjente lymfatiske vev og strukturer, men det oppfører seg også annerledes. Vi har så langt ikke vært i stand til å klassifisere det som hverken et primært eller sekundært lymfatisk organ. Vi har nylig diskutert disse forholdene inngående i en oversiktsartikkel med åpen tilgang (5), og der gjennomgås litteraturen som har blitt publisert rundt ILT, det meste med opphav fra Faggruppe for anatomi ved Veterinærhøgskolen. Men det stoppet ikke med det.

Fiskens bursa

En del fiskearter har noen eiendommelige kanaler som forbinder bukhulen med det omkringliggende miljøet i og med at de munner ut på hver side av anus (6). På tidlig 2000-tall spekulerte Inge Bjerkås og sisteforfatter (EOK) på om disse kanalene kunne være en manifestasjon av fuglens bursa Fabricii. Vi foretok noen innledende undersøkelser med snitt av analområdet, men det var et forvirrende bilde. Vi fant ansamlinger av lymfoide celler, men antok at dette skyldtes vaksineeffekter etter intraperitoneal vaksinering av fisken. Ansamlinger av B-liknende celler ble imidlertid ikke observert, og grunnet andre oppgaver og lite lovende innledende funn ble det hele lagt på is i mange år.

I 2018 ble stud.med.vet. Oskar Mongstad Løken engasjert på timebasis ved Faggruppe anatomi. Han fikk blant annet i oppdrag å lage snitt av anusområdet av laks for å få en nærmere oversikt over abdominalkanalene. Oskar Løken gikk så inn i forskerlinjeprogrammet ved NMBU Veterinærhøgskolen og fikk tid til å gå metodisk til verks i sine undersøkelser. Vi passet nå på å bruke uvaksinert fisk i arbeidet. Dette resulterte i at det i tillegg til de to kanalene vi i utgangspunktet var ute etter, fant vi en tredje kanal som var full av immunceller (Figur 6). Først var situasjonen noe forvirrende, men det viste seg at kanalen var en innkrengning bak urogenitalpapillen. Denne innkrengningen, eller bursaen som vi begynte å kalle den, kan anta anselig størrelse, opptil 2 cm hos voksen laks (Figur 7), og den har tidligere ikke vært beskrevet. Med sitt betydelige innhold av immunceller var det innlysende at vi nå måtte konsentrere oss om dette funnet.

På dette tidspunktet hadde vi fått etablert en gammel teknikk i fornyet og forbedret versjon ved faggruppen. Det handler her om in situ hybridisering som kan visualisere ekspresjon av gen på histologiske snitt med en høy sensitivitet og spesifisitet. Førsteforfatter (HB) har hatt ansvaret for etableringen av in situ hybridisering ved faggruppen, og den kunne nå benyttes i karakteriseringsarbeidet av den nye strukturen. Igjen var Ivar Hordvik en viktig samarbeidspartner. Resultatene av disse undersøkelsene var oppsiktsvekkende. Det viste seg at bursaen hadde et dynamisk lymfoepitel og at innkrengingen bak urogenitalpapillen hadde analog utvikling med bursa Fabricii hos fugl (Figur 8). Videre var dynamikken i immuncellene analog med tidlige stadier hos fuglens bursa. Hos fugl er bursa Fabricii et organ for proliferasjon og modning av B-celler. Men hos laksen dominerer T-cellene, og det dannes ingen follikler. Derimot er det et tykt lymfoepitel som forsvinner etter kjønnsmodning og ser da ut som vanlig hud. Dette er til forskjell fra ILT som fortsetter å vokse etter hvert som fisken blir større og kjønnsmodnes. Disse resultatene ble publisert i 2020 (7). Vi er altså ennå i den spede fasen av å forstå hvilken betydning og funksjon laksens bursa har. Men det er ikke unaturlig å spekulere rundt prosesser for diversifisering og modning av T-celler.

Evige anatomiske sannheter

Disse funnene, med noe over 10 års mellomrom, viser at vi ennå kan oppleve nye oppdagelser innen anatomisk forskning, til og med på makroskopisk plan. ILT er godt synlig hos større fisk, den ligger som en pølse på enden av gjellens interbranchiale septum og sikk-sakker seg mellom primærlamellene. På transversalsnitt av gjeller av stor fisk tverrkuttes ILT, som så kan observeres som en grålig struktur slik som man i utgangspunktet forventer det av et lymfatisk organ. Laksens bursa er stor og velutviklet og umulig å overse dersom man studerer gattområdet. Skal man foreta anal intubering av laks og ørret, er det faktisk et problem å unngå bursaen. Men alle som har sett den har nok antatt at dette bare har vært en foldet struktur bak urogenitalpapillen. Vi reagerte først på bursaen da vi fikk se histologiske snitt av den, og selv da visste vi ikke helt hva vi observerte i og med at vi aldri har bitt oss merke i denne helt åpenbare strukturen før. Vi måtte gå tilbake til makroskopiske undersøkelser for å forstå sammenhengen. Da vi begynte å studere disse forholdene mer inngående, viste det seg at fuglens bursa Fabricii utvikler seg nøyaktig i samme lokalitet. Men på mange tegninger av bursa Fabricii er den skissert som en divertikkel av tarmen. Den er sjelden skissert i sammenheng med kjønnsveier og urinkanal. Dette gir et ytterst misvisende bilde og kan ha bidratt til at mange fiskeforskere ikke har gjort koblingen mot fugl selv om de har sett strukturen hos fisk. Det gjorde heller ikke vi før vi fikk histologiske snitt av strukturen. Oskar Løkens innsats var meget viktig i denne tidlige fasen. Hans inngående fordypning i organogenesen av fuglens bursa Fabricii gjorde at vi kunne trekke likhetene og vise en analog utvikling som ikke utgikk fra tarmens endoderm, men fra hudens ektoderm, og da falt det hele på plass. Sammen har Erlend Haugarvoll med sitt pionerarbeid rundt ILT og Oskar Mongstad Løken med sin identifisering av laksens bursa (Figur 9) betydd svært mye for anatomisk forskning relatert til immunstrukturene hos fisk.

Så den makroskopiske anatomiske forskningen var ikke død! Den er en høyst levende vitenskap med mange overraskelser i mente for den som leter med et åpent sinn. Det er betegnende at ved funnene av ILT og laksens bursa ble vi først oppmerksomme på strukturene som følge av mikroskopiske undersøkelser. I etterkant viste det seg at det vi fant uten problem kunne observeres som strukturer uten bruk av annet instrument enn ens egne øyne. Det burde gi noen og enhver noe å tenke på.

Veien videre

Ved Faggruppe anatomi på NMBU Veterinærhøgskolen vil vi fortsette å konsentrere oss om lymfatiske strukturer hos fisk. Vi har som mål at vi en dag kan fortelle hva disse strukturene betyr, hvordan de fungerer og hvordan vi eventuelt kan bruke dem i diagnostikk og profylaktisk arbeid. I disse dager skal vi ansette en ny stipendiat som skal arbeide med laksens bursa. Men det er viktig å prøve å se hele fiskens immunsystem under ett. De to organene vi har identifisert skjuler hemmeligheter som vi så langt bare så vidt har begynt å avdekke. Hvordan de passer sammen og interagerer med resten av fiskens immunsystem er et åpenbart tema for videre forskning. Videre må disse lymfatiske organene settes inn i en evolusjonær sammenheng. Det vil bli en stor utfordring. Det er ikke mangel på interessante arbeidsoppgaver i årene som kommer.

Etterskrift

Forfatterne takker Erlend Haugarvoll, Oskar Mongstad Løken, Ivar Hordvik og Inge Bjerkås for gjennomlesning og kommentarer til dette manuskriptet.