Fagaktuelt
Cellelinje fra rognkjeks-gjeller etablert:

Kan kanskje hjelpe oss å forstå mer av artens biologi

Forskningsgruppen på Veterinærinstituttet, BioDirect, har laget en cellelinje fra rognkjeksens gjeller (Sindre 2021). Egenskapene og utseendet den har, tyder på at det er en celletype som ligner den man finner på innsiden av blodkar (endotel) eller på overflaten av gjeller (gjelle-epitelceller). Studiene av cellelinjen viser at den har lovende egenskaper som en biosensor for giftstoffer og kan brukes til å dyrke en rekke fiskepatogene virus. Det er vårt håp at cellelinjen på lang sikt kan bli et nyttig verktøy for å forstå mer av rognkjeksens biologi og redusere bruken av forsøksdyr.

Hilde Sindre
Mona Gjessing
Johanna Hol Fosse
Lene Hermansen
Inger Böckerman
Marit Amundsen
Maria Dahle
Anita Solhaug

Kunnskap om fiskehelse

I denne spalten vil Veterinærinstituttet i hvert nummer bidra med oppdatert kunnskap om fiskehelse. Ansvarlig for spalten er forsker Mona Gjessing mona.gjessing@vetinst.no

Denne artikkelen sto på trykk i Norsk Fiskeoppdrett nr. 10, 2021.

Introduksjon

Rensefisk, hovedsakelig rognkjeks (cyclopterus lumpus), blir i økende grad brukt til biologisk avlusning. Data fra Fiskeridirektoratet viser en eksplosiv økning i bruk av rensefisk fra 2010 og fram til i dag. Ifølge forskning.no viser tellinger at fire av ti rensefisk dør i løpet av en lakseproduksjon. Det er en kontinuerlig påfylling av ny rensefisk for å opprettholde aktive lusespisere, men hva som er dødsårsaken til rensefisken som faller fra, har vi altfor liten oversikt over.

Biodiversiteten innen ulike fiskearter er svært stor og det påvirker deres utseende, økologi og adferd og andre sider ved deres biologi. Ulike fiskearter har utviklet seg over flere hundre millioner år og utviklingsmessig er rognkjeks en mye yngre art enn for eksempel laks, og de biologiske forskjellene er store. Rognkjeks sliter med flere kjente sykdommer forårsaket av bakterier, virus og parasitter, men i mange tilfeller er årsakene til at fisken blir syk, uklare. Gjellesykdommer er ett av flere sykdomskompleks vi vet skaper problemer hos både rognkjeks (figur 2) og laks, men hos rognkjeks er kunnskapen svært mangelfull. Vi har laget en cellelinje fra rognkjeks for å få mer kunnskap om arten og vårt håp er at den kan bli et verktøy som kan bidra til reduksjon av bruk av rognkjeks som forsøksdyr (figur 1).

I tillegg er det bekymringer knyttet til risiko for overføring av sykdomsagens mellom laks og rognkjeks, når de holdes i samme miljø. Eksempel på en alvorlig listeført virussykdom som er funnet i rognkjeks er viral hemorragisk septikemi (VHS), en sykdom vi frykter og som norsk oppdrett for tiden heldigvis er fri for. Siden cellelinjen er mottakelig for en rekke fiskevirus, deriblant viralt hemorragisk septikemivirus (VHSV), kan den også benyttes som et ledd i sykdomsoppklaring hos denne arten og dermed bidra til at kjente og nye smittsomme agens kan oppdages og risiko for introduksjon til annen oppdrettsfisk kan reduseres.

Figur 1. Cellelinjen har avgiftningsmekanismer, er mottakelig for en rekke virus og danner tett barriere.

Figur 2. Bildet til venstre viser normale gjeller fra rognkjeks, med slanke, fine respiratoriske enheter. Høyre: Gjeller fra rognkjeks med alvorlige sammenvoksinger av respiratoriske enheter med blødninger, betennelse og mistanke om tilstedeværelse av parasitter og bakterier.

Hvordan gikk vi fram for å lage cellelinjen?

En voksen rognkjeks ble avlivet og en gjellebue ble klippet ut og lagt på en væske med næringsstoffer og antibiotika («medium») slik at cellene på gjellen ikke skulle dø. Deretter klippet vi ut noen små biter av gjellefilamenter og la dem på en petriskål og skar dem opp i enda mindre biter med en skalpell. Noe av disse bitene la vi inn i en liten flaske med medium, og etter bare en dag hadde det begynt å vokse celler ut fra det stedet vi hadde skåret gjellen (figur 3).

Figur 3. Gjellefilamenter (pil) og området rundt er dekket av celler. Et tett lag av celler kunne ses allerede etter fire dager etter at gjellebitene ble lagt i dyrkningsflasken.

Gjellecellelinjen fra rognkjeks er en overflatecelle

Når vi så på cellene i mikroskop, så vi at de var flate (figur 4) og elektronmikroskopiske undersøkelser der vi kan se veldig små strukturer, til og med forbindelser mellom cellene, viste at de kan lage en barriere. Når vi farget cellene på en måte der vi kan se om spesielle cellestrukturer er til stede, så vi at cellene var positive for cytokeratin (figur 4) og et celleadhesjonsmolekyl som begge er typisk for celler som lager barriere.

Figur 4. Bilder av etablerte rognkjeksceller fra lysmikroskop (venstre) og etter farging med en markør for overflateceller cytokeratin (grønn), cellekjernen er farget blå.

Hvorfor er cellelinjer viktige og hva kan de brukes til?

I Norge er forbruk av forsøksfisk høyt. Det brukes mest laks, men i takt med behovet for å forstå mer av rensefiskens biologi øker også bruken av rognkjeks. For å ivareta fiskevelferd bør slike forsøk – i den grad det er mulig – erstattes med modeller. Dette er også i henhold til de tre Rer som står for «Replace, Reduce, Refine». En cellelinje vil kunne danne et godt utgangspunkt for en slik modell.

Gjellen er et organ som er i direkte kontakt med miljøet, og er derfor svært utsatt for skade og infeksjon. Epitelcellene er ytterst og i direkte kontakt med vannet. En modell av epitelceller vil kanskje kunne øke forståelsen av hva gjellene tåler. Epitelceller i gjellene fungerer også som en barriere, og kan forhindre at toksiske stoffer og patogener passerer fra vannet og inn i fisken. Barrierens egenskaper og evnen til å slippe forskjellige stoffer igjennom er også noe man også kan studere ved å dyrke cellene på et gjennomtrengelig filter i et såkalt transwell system (figur 5). I dette arbeidet har vi funnet at rognkjekscellene har evnen til å lage en slik barriere når de dyrkes i dette transwell systemet og de funnene stemmer bra med det vi observerte ved mikrokopi. Dette er et godt utgangspunkt for videre bruk av cellelinjen og kan kanskje si oss noe om hva fisken tåler – før man setter opp et fiskeforsøk.

Figur 5. Rognkjeksceller dyrket i et transwell system.

Aktivitetsmåling av enzymet CYP1A er ofte brukt som en biosensor for visse miljøgifter, siden CYP1A har som oppgave å ufarliggjøre en del giftstoffer. Rognkjekscellelinjen er vist å kunne indusere en slik enzymaktivitet, og den har derfor et potensiale for å bli brukt som en biosensor for avgiftning av miljøgifter som krever CYP1A aktivitet.

Cellene er mottagelige for en rekke virus

Cellene var mottakelige for salmonid alfavirus (SAV) 1, fiske nodavirus (BFNNV genotype), infeksiøs hematopoetisk nekrosevirus (IHNV) og viralt hemorragisk septikemivirus (VHSV) genogruppe IIp III (fig 6) noe som gjør at dem nyttige bl.a i forbindelse med diagnostikk og utredninger av virussykdommer.

Figur 6. Rognkjeksceller med viralt hemorragisk septikemivirus. Venstre: Cellekjerner er farget røde. Høyre: Grønn farging viser proteiner fra viralt hemorragisk septikemivirus i cellene.

Referanse:

  1. Sindre H, Gjessing MC, Fosse JH, Hermansen LC, Böckerman I, Amundsen MM, Dahle MK, Solhaug A. Establishment and Characterization of a Novel Gill Cell Line, LG-1, from Atlantic Lumpfish (Cyclopterus lumpus L.). Cells. 2021. 10(9):2442.

Bio-Direct-prosjektet

Deltagere i BIO-DIRECT-prosjektet er: Marit Amundsen, BioDirect leder Maria Dahle, Mona Gjessing Hilde Sindre, Gunnar Eriksen, Johanna Hol Fosse og team-leder Anita Solhaug. Bio-Direct (Biomarkers and Bioassays for Veterinary research and Diagnostics) er et internt satsningsprosjekt ved Veterinærinstituttet. Produksjon av organliknende cellemodeller er et av hovedmålene i Bio-Direct, og et eget team er satt sammen for å nå dette målet. Teamet ledes av Anita Solhaug, og har spesielt god kompetanse på epitelcellesystemer. Det jobbes ikke bare med gjeller fra fisk, men også med tarmcellesystemer fra hund. Nå skal vi jobbe videre med å etablere enda mer avanserte systemer som «organ-on-a-chip» i Veterinærinstituttets nye lokaler med nytt og moderne utstyr.